Китайские специалисты в области биоинженерии разработали молекулярный инструмент smACGmax, который способен одновременно заменять три типа нуклеотидов в определённом участке ДНК. Эта технология предназначена для направленной эволюции генов, что позволяет создавать клетки с новыми полезными свойствами и ускорять процесс разработки лекарственных средств.

Принципы направленной эволюции

Направленная эволюция in situ представляет собой лабораторную имитацию естественного отбора. В ходе этого процесса в целевой ген вносятся многочисленные случайные мутации, после чего отбираются наиболее удачные варианты. Такой подход необходим для быстрого создания белков и клеток с новыми характеристиками, например, устойчивостью к заболеваниям или токсинам. В природе подобные изменения могли бы возникнуть только спустя миллионы лет или не появиться вовсе. В последнее время были разработаны ещё две системы, способные одновременно заменять несколько нуклеотидов.

Технологическая основа smACGmax

В основе smACGmax лежит система CRISPR/Cas9, которая позволяет разрезать ДНК в заданных местах. Однако для целей направленной эволюции требуется не разрушать ген, а изменять его последовательность максимально разнообразными способами. Для этого был использован белок Cas9n, который делает надрез только на одной цепи ДНК. Внутрь Cas9n встроен комплекс из нескольких ферментов: цитозиновой и адениновой деаминаз (разрушают цитозин и аденин) и ДНК-гликозилазы, удаляющей повреждённые основания. Для удаления гуанина была добавлена модифицированная версия человеческой гликозилазы. Полученная система получила название smACGmax.

Механизм работы

Система действует следующим образом: на одной цепи ДНК образуется пустота на месте повреждённых и удалённых оснований, а вторая цепь, которая обычно служит шаблоном для восстановления первой, также надрезается. В такой ситуации система репарации оснований (BER) не может функционировать. Клеточные транслезионные полимеразы вставляют на место удалённых аденина, цитозина или гуанина случайные основания.

Экспериментальное применение

Система была протестирована на человеческих клетках (HEK293T и HeLa). В ходе эксперимента был изменён ген HBEGF, кодирующий рецептор, через который в клетку проникает дифтерийный токсин. В результате работы редактора в клеточных культурах появилось множество случайных вариантов этого рецептора. После добавления токсина в питательную среду выжили только те клетки, в которых рецептор оказался невосприимчивым.

Ограничения метода

Редактирование гуанина на данный момент стабильно работает только при наличии рядом определённой последовательности нуклеотидов (мотив NGR), поэтому эффективность замены гуанина ниже по сравнению с другими основаниями.